一、 目的

        使用恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、了解細(xì)胞分裂素對離體子葉的保綠作用及基本原理和方法。

二、原理  細(xì)胞分裂素可阻礙核酸水解酶和蛋白水解酶的產(chǎn)生，因此能延緩器官衰老，使離體葉片保綠，保綠作用的強(qiáng)弱可通過測定葉綠素含量的變化來衡量，也可由葉色變黃枯死的時間來衡量。 

三、材料、儀器設(shè)備及試劑 

1. 材料：黃瓜子葉；蘿卜子葉。 

2.  儀器設(shè)備：電子分析天平；分光光度計；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫水浴鍋；25ml容量瓶；25ml刻度試管；試管架；移液管；黃瓜子葉的培養(yǎng)皿（直徑5cm）；瓷盤；刀片；尖頭鑷子；濾紙；吸耳球等。 

3. 試劑及配制：100μg·ml－16－BA溶液；95﹪乙醇 ；CaCO3粉末。  100μg·ml－16－BA母液配制：準(zhǔn)確稱取6－BA 10mg,  加幾滴1mol·L－1HC1溶解（可稍加熱溶解），然后慢慢加入蒸餾水稀釋后定容至100ml。 

四、實(shí)驗(yàn)步驟 

1. 黃瓜幼苗的培養(yǎng)  精選黃瓜種子，播入墊有濾紙的瓷盤中，加蒸餾水使之濕潤（注意種子不能漬水），待種子萌發(fā)后，在光下培養(yǎng)2～3d左右，直至子葉綠化。備用。 

2. 系列濃度6－BA溶液配制：吸取100μg·ml－16－BA母液，稀釋成10、5、0.5  μg·ml－1的系列濃度溶液。 

3. 離體黃瓜子葉的培養(yǎng) 

（1）取4套培養(yǎng)皿，編號，每套培養(yǎng)皿各墊一張濾紙，分別作0.5、5、10μg·ml－1的6－BA溶液和蒸餾水(CK)4個處理，即為組。 

（2）選取子葉大小、生長一致的黃瓜幼苗20株，每處理5  株（10片子葉），用刀片切下不附帶葉柄的子葉，分別稱取鮮重，將數(shù)據(jù)記入下表中。然后將子葉放入組相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿中，分別加入不同濃度的6－BA溶液3ml,  對照（CK）加蒸餾水3ml。蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于暗處，溫度25－28℃培養(yǎng)3 d 。  另取與組相同的黃瓜幼苗20株，用刀片切下不附帶葉柄的子葉作第二組，直接用來測定葉綠素含量。 

4. 第二組黃瓜子葉葉綠素含量的測定 

（1）葉綠素的提取  取3支25ml刻度試管，編號。稱取第二組的黃瓜子葉三份（3個重復(fù)），每份10片子葉，然后放入相應(yīng)編號的刻度試管中，各加入少量CaCO3粉及95﹪乙醇3－4ml，用玻棒小心將子葉搗碎后，將試管放入45℃恒溫水浴提取葉綠素30min左右，直到子葉碎片無色為止，用濾紙過濾于25ml容量瓶中（如殘渣仍帶綠色，可再加幾ml乙醇繼續(xù)提取，直至殘渣無綠色）。濾紙上的色素用乙醇慢慢點(diǎn)滴清洗入容量瓶中，后定容至刻度，搖勻，待測。 

（2）葉綠素含量的測定  在652nm波長處，以95﹪乙  醇為空白對照，測定葉綠素提取液的吸光度（A值）。并按公式計算出葉綠素含量。即為培養(yǎng)前子葉的原始葉綠素含量。 

5. 組黃瓜子葉葉綠素殘留量的測定  組黃瓜子葉在暗處培養(yǎng)3d后，按上述第（4）步驟方法分別測定各處理子葉葉綠素含量，并按公式計算出各處理葉綠素含量，即為暗培養(yǎng)后子葉葉綠素含量。 

五、結(jié)果計算  葉綠素含量計算公式：

D652 × 提取液總量（ml）  葉綠素含量（mg·g－1Fw）= ——————————————  34.5 × 樣品鮮重（g）  公式中：D652 — 在652nm波長下測定的吸光度值  34.5— 葉綠素a、b在652nm波長處的比吸收系數(shù)  培養(yǎng)后葉綠素含量  暗培養(yǎng)后葉綠素含量占培養(yǎng)前葉綠素含量（﹪）= —————————×100  培養(yǎng)前葉綠素含量

六、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、詳情可咨詢喆圖小編。