實驗方法原理

       HL-60細胞是一種急性早幼粒細胞白血病細胞，在體外無需加刺激因子，可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細胞分化誘導劑，經二甲基亞砜處理后的HL-60細胞按粒系途徑定向成熟分化，同時細胞的增殖力降低，幾乎全部細胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此，這種方法可用于細胞分化的基礎研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。

 

       實驗材料        HL-60細胞

       試劑、試劑盒        小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、臺盼蘭、瓊脂、二甲基亞砜

       儀器、耗材        超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、顯微鏡、培養(yǎng)瓶、吸管、酒精燈、血細胞計數(shù)板、多孔培養(yǎng)板

 

       實驗步驟        

       1.  收集對數(shù)生長期的HL-60細胞，先按實驗十三測定細胞活力，然后調整細胞濃度，制成300~1 000活細胞/ml 的細胞懸液。

       2.  取二個培養(yǎng)瓶每個瓶中加9 ml 調整好濃度的細胞懸液，然后各加入1 ml 3%瓊脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混勻。

       3.  用微量加樣器吸140 μl 二甲基亞砜（MDSO），加到一個瓶中，充分混勻，為實驗組，另一瓶不加DMSO，為空白對照組。

       4.  取一個16 mm 多孔培養(yǎng)板，每孔加1 ml（35 mm 培養(yǎng)皿需加2 ml）細胞瓊脂懸液，勿有氣泡，將實驗組和對照組分兩組加好，蓋上蓋并作好標記。

       5.  在室溫放置20分鐘使細胞瓊脂懸液凝固。

       6.  然后移培養(yǎng)板或平皿于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃進行培養(yǎng)。

       7.  培養(yǎng)7~10天，肉眼觀察并計數(shù)細胞集落。

       8.  結果：以肉眼可見的細胞團（含500個以上細胞）作為計數(shù)集落的標準。對照組HL-60細胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，每個孔中可見有多個集落形成，而實驗組HL-60細胞因經二甲基亞砜誘導分化，細胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。

       9.  集落的計數(shù)和計算：

       （1）集落數(shù)=n孔中細胞集落數(shù)總和/n孔

       （2）集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細胞總數(shù)×100%