（1） 準備

   無菌超凈臺，酒精燈，75%酒精噴壺，二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃水浴鍋，離心機；培養(yǎng)瓶，含10%胎牛血清的*培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及PBS磷酸緩沖液（提前放置超凈臺使平衡到室溫），無菌工作服（白大褂），kou罩，手套，記號筆

（2） 步驟

   1.穿好無菌工作服，帶上*罩和手套，快速從液氮里取出凍存管，快速放進37℃水浴鍋緩慢搖晃使細胞解凍，注意凍存管的封口膜不要破裂，防止污染。

   2.解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴，酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處。

   3.開超凈臺，點燃酒精燈燃燒片刻后（可提前準備），凍存管放超凈臺，換新手套，小心打開凍存管，避免污染，無菌吸管將1ml細胞全部吸出至5ml無菌EP管，補加9ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，1000rpm，離心5min使細胞沉淀，棄上清。

   4.加入新鮮配制的含10%血清的培養(yǎng)基4ml，輕輕混勻，用吸管將細胞移至25T培養(yǎng)瓶。

   5.平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

   6.培養(yǎng)24小時后，顯微鏡觀察細胞（貼壁細胞）貼壁后，小心更換培養(yǎng)基，根據(jù)不同細胞的生長狀態(tài)進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶上標記：操作者，時間，細胞類型。

   7.有的實驗員的培養(yǎng)基會加入抗生素防止細胞污染，但是這對于掌握細胞培養(yǎng)是非常不利的，不加抗生素培養(yǎng)細胞更能提醒實驗者無菌操作的意識。一旦細胞出現(xiàn)污染，易于發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)污染的細胞應(yīng)立刻煮沸丟棄，以免污染同實驗室其他細胞。

   8.細胞長滿90%-100%即可傳代，小心打開培養(yǎng)瓶，瓶口過酒精燈消毒，棄培養(yǎng)基。

   9.加入1mlPBS，潤洗細胞，重復(fù)3次，棄PBS。

   10.加入4ml*培養(yǎng)基，用無菌吸管小心吹打貼壁細胞或者用胰蛋白酶消化細胞使細胞脫落。

   11.轉(zhuǎn)移1/2脫落的細胞至新的培養(yǎng)瓶，各瓶補加*培養(yǎng)基至4ml。

   12.小心封口，平躺放置培養(yǎng)瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

   13.待長滿后，按同樣的方法傳代培養(yǎng)。二  凍存

當不需要使用細胞或者細胞量足夠時，可以將細胞凍存起來，供以后實驗用

（1） 準備自

    細胞凍存液（20%血清、10%DMSO、70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液），梯度降溫盒

（2） 步驟

        1.選取活力好，密度約70%細胞用于凍存，此時細胞處于對數(shù)生長期，用于凍存。

        2 .細胞吹打或者胰酶消化后，轉(zhuǎn)移至無菌EP管，1000rpm里面5min。

        3.棄上清，加入新鮮配制的細胞凍存液，25T細胞可以加入2ml細胞凍存液，分裝2個凍存管，細胞密度為5*106-1*107個每ml。

        4.做好標記，放入梯度降溫盒（提前平衡至室溫）。

        5.將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過夜，DI二天取出凍存管，快速放入液氮保存。

氧化碳培養(yǎng)箱是進行細胞培養(yǎng)的必要設(shè)備，那么在培養(yǎng)細胞時有哪些經(jīng)驗是我們可以借鑒的呢？下面讓我們一起來看一下。

1、啟蒙老師的重要性

一般進實驗室都有師兄師姐帶著做，他們就是你做細胞的啟蒙老師。他們的操作手法、細節(jié)、理論講解就成了你操作的準則，如營養(yǎng)液、細胞瓶的擺放位置；滅菌處理程序；開蓋手法；細胞吹打手法等等。要學(xué)會他們的正確操作，在DI一次的時候就要重視。

2、像養(yǎng)孩子一樣養(yǎng)細胞

細胞真的很脆弱，*好每天都去看看它，以防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、缺二氧化碳、停電、溫度不夠等異?，F(xiàn)象，也好及時解決這些意外，避免重復(fù)實驗帶來的更大痛苦。

3、好細胞要及時保種

細胞要分批傳代，這樣即使有一批出了問題，還有一批備用的。像后者一般人可能不容易做到。有一次細胞污染了，全軍覆沒。當時可后悔沒有保種。

4、每種細胞都有自己的特性，要區(qū)別對待。

細胞跟人一樣，不同的細胞，培養(yǎng)特性是不一樣的。培養(yǎng)過程中要細細體會。不同細胞株使用不同的培養(yǎng)基和血清。

如平滑肌細胞很活躍，喜歡熱鬧，2~3 天就好多人口，而且不太愛吃喝，真是*好養(yǎng)的孩子了。內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞性格相近，不過它很不講衛(wèi)生，也很邋遢，里面有很多分泌屋，要經(jīng)常換洗才行。RAW264.7 細胞也很開朗，而且很能吃，要經(jīng)常喂它，頭疼的是細胞很容易活化，培養(yǎng)它的瓶子和環(huán)境沒有內(nèi)毒素才好。

5、培養(yǎng)前的工作準備充分

包括耗材的處理、試劑的配置，無菌檢驗等等。
玻璃器皿的清洗。對于玻璃器皿（細胞瓶、裝營養(yǎng)液的瓶子、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干凈（注意死角），然后沖干凈。用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水沖洗 10 遍，除去殘留酸液。瓶子之類，沖洗過程要使勁搖晃。然后在雙蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎，160℃ 干烤 2 h 待用。
試劑配置。細胞培養(yǎng)用的液體一般使用雙蒸以上的水即可。并注意 pH 值的調(diào)節(jié)。
無菌檢驗。主要采用過濾除菌：如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各類培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。有些可以采用高壓滅菌：如 PBS、D-Hank's等。

6、試劑分裝保存

包括營養(yǎng)液、胰酶、血清等。

血清特別重要。血清必須貯存于 –20℃，如果一次無法用完一瓶，可將 40～50ml 分裝于無菌酸處理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。一般廠商提供的血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。（一般情況下不影響細胞培養(yǎng)）

瓶裝血清一定要逐步解凍: 4℃ 冰箱全溶后再分裝，在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

熱滅活是指 56℃，30 分鐘加熱已*解凍之血清。水浴鍋升到 56℃后，將血清放入，待溫度升高到 56℃ 后計時，一般 5 分鐘左右規(guī)則搖晃均勻一次。此熱處理之目的是使血清中之補體成份去活化。除非必須，一般不要作此熱處理，因為會造成沉淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。注意更換新血清（包括不同批次）對細胞的影響。

7、無菌意識要強

實驗進行前，超凈臺以紫外燈照射 30 分鐘滅菌，以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟超凈工作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)數(shù)分鐘后，才開始實驗操作。

每次操作只處理一株細胞株，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。

無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暫時放置，其它個人實驗用品用完應(yīng)立即拿出。實驗用品以 70% 乙醇擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在中央無菌區(qū)域，一般勿在邊緣區(qū)域操作。

小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

8、選擇正確的培養(yǎng)基 

不同的細胞可能培養(yǎng)基不同，甚至不同的文獻可能對相同的細胞培養(yǎng)基成分也是可能不同的。如我當時培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，有文獻就選用 neurobase 培養(yǎng)基，而我的實驗?zāi)康闹饕亲隹寡趸脱趸矫娴?，而這種培養(yǎng)基中含有抗氧化劑成分，此時，我就不得不選擇另外一種不含抗氧化劑的培養(yǎng)基。

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